Biomek i3 自动化细胞转染 DOE—— 让转染条件探索这一步，更稳定也更省心

本文描述了在 HEK293 细胞系中，使用 贝克曼库尔特（Beckman Coulter）Biomek i3 自动化工作站执行脂质体瞬时转染 DOE（Design of Experiments）的实验流程与结果。
实验重点在于通过自动化方式执行细胞铺板、转染体系制备、时间控制加样及混匀操作，以减少人为操作差异对 DOE 结果的影响。
转染效果通过荧光显微成像及 Beckman Coulter CytoFLEX 流式细胞分析仪进行评估。实验结论仅基于观察数据，用于支持后续转染条件优化与工艺选择。

一、研究背景

细胞瞬时转染常用于基因表达分析、蛋白功能研究及相关生物学研究。在开展相关实验之前，通常需要通过 DOE 的方式对转染条件进行初步探索，包括 DNA 投加量与转染试剂用量范围等。

在 DOE 场景中，实验涉及多种变量与重复条件。手工操作在体积控制、时间控制及跨孔一致性方面存在一定难度。

为降低操作差异对 DOE 结果的影响，本实验采用 贝克曼库尔特（Beckman Coulter）Biomek i3 桌面级自动化工作站执行与转染相关的液体处理操作。

二、实验概述

1. 使用平台与检测方式

  • 自动化平台：Beckman Coulter Biomek i3
  • 成像检测：EVOS（明场与 GFP）
  • 流式检测：Beckman Coulter CytoFLEX 流式细胞分析仪

Biomek i3 用于执行细胞铺板、转染体系制备、加样和混匀等步骤，检测环节独立完成。

三、实验中关注的主要问题

1. 实验变量较多

本实验中涉及的变量包括：

  • 细胞铺板密度
  • DNA 投加量
  • 转染试剂用量
  • 预混与加样的时间间隔
  • 加样位置与混匀方式

在 DOE 条件下，需要尽量减少非设计变量带来的影响。

2. 转染步骤中的时间控制

在脂质体转染流程中，DNA 与转染试剂混合后至加样的时间间隔可能对结果产生影响。
因此，本实验对该时间间隔进行统一控制，以提高不同条件之间的可比性。

四、实验流程

1. 细胞铺板

  • 细胞系：HEK293
  • 板型：96 孔平底黑壁透底板
  • 接种密度：
    • 25,000 cells / 100 μL
    • 50,000 cells / 100 μL

铺板完成后，使用 i3X MiniMax 成像模块对细胞沉降和状态进行确认。

2. 转染体系设置

根据试剂说明书，设置以下条件组合：

  • DNA：100 ng vs 400 ng / 孔
  • Lipofectamine：0.15 μL vs 0.3 μL / 孔
  • P3000：按说明书比例
  • 稀释体系：Opti-MEM

所有体系由 Biomek i3 按 DOE 布局制备。

图1：Biomek i3 DOE板布局

3. 预混与加样控制

  • 各预混体系通过程序错峰启动
  • DNA/转染试剂预混至加样的时间统一为 12 分钟
  • 加样位置为液面下约 1 mm
  • 加样后采用缓慢吹吸配合倾斜混匀

上述操作用于统一处理条件，不对转染机制作额外假设。

4. 培养与检测

  • 培养条件：37 °C，5% CO₂
  • 成像：EVOS（明场与 GFP，参数保持一致）
  • 流式分析：
    使用 Beckman Coulter CytoFLEX，采用标准门控流程完成定量分析。

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图2：Biomek i3方法选项选择器MOS，支持轻松访问最常用的DOE方法设置

五、实验结果（基于观察）

  1. 在 400 ng DNA 条件下，部分条件中观察到转染信号下降的情况。
    该结果与细胞毒性相关的已有认知一致，但本实验未进一步探讨机制。
  2. 在 25,000 cells 接种密度条件下，0.15 μL 与 0.3 μL Lipofectamine 在转染结果上未观察到明显差异。
    该观察结果为后续条件筛选提供参考。

图3：在每孔细胞接种密度为25000个细胞的四种预混体系条件下的典型荧光显微成像

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图4：代表性的流式细胞术门控策略，从左上角顺时针：选择细胞、选择单线态细胞、将荧光门应用于阴性对照（仅限培养基）孔和将荧光门用于转染细胞孔

六、关于 Biomek i3 在本实验中的作用说明

在本实验中，贝克曼库尔特 Biomek i3主要用于：

  • 执行统一的液体处理操作
  • 控制加样体积与时间间隔
  • 支持 DOE 条件的重复执行

本实验结果用于评价转染条件本身，不用于比较自动化与手工操作在转染效率上的差异。

FAQ

Q1：本实验是否证明自动化可以提高转染效率？

否。本实验仅关注操作一致性对 DOE 数据可比性的影响，未比较效率高低。

Q2：Biomek i3 在实验中解决了什么问题？

主要用于减少体积、时间和混匀方式上的人为差异。

Q3：是否必须搭配 CytoFLEX 使用？

不是。CytoFLEX 仅作为本实验的定量检测工具之一。

Q4：实验结果是否可以直接外推到其他细胞系？

不可以。不同细胞系需单独进行条件优化。

 

参考文献

应用说明《使用Biomek i3自动化工作站进行自动化细胞铺板和基于脂质体的瞬时转染实验设计（DOE）》


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