AMPure XP磁珠试剂PCR纯化方案

耗材和硬件

• 反应板
• SPRIPlate磁力板： SPRIPlate96孔磁力板，底部圆形磁环或者 SPRIPlate 384 孔板磁力架(侧面吸附)
• 板密封、胶封或热封
• 移液机器人或多通道手动移液器（推荐）

注意: 了解有关AMPure XP PCR 纯化系统 Biomek i5 多通道 96 孔板基因组学工作站中自动化应用的更多信息，请阅读本 应用指南。

试剂

• 70%新配制乙醇
• 用于 DNA 洗脱的试剂级水（水、TRIS-Acetate（10 mM pH 8.0）或 TE 缓冲液（10 mM Tris-Acetate pH 8.0，1 mM EDTA）

1. 振摇AMPureXP试剂瓶，以重悬任何可能已经沉降的磁珠颗粒。然后根据下表所示样品反应体积加入AMPure XP试剂。

   注意: 无法在384孔PCR板的孔内纯化大于14μL的反应体积，因为样品加试剂的总体积大于该体积，如下式所示：

   (14 μL 样品反应体积 n + 25 μL AMPure XP = 39 μL)

   样品反应体积 (μL)	AMPure XP体积e (μL)
   5	9
   7	12.6
   10	18
   14	25

   AMPure XP试剂加入体积可由以下公式计算得出：

   (每次加入的 AMPure XP 体积) = 1.8 x (反应体积)

2. 该步骤中，100 bp 或更大的 DNA 片段将与磁珠结合。相比涡旋，移液器混合效果更佳，因为其结果更具可重复性。充分混匀后，混合物的颜色应呈均相状态：

   —使用移液器吸头反复吹打10次，使试剂和样品充分混匀。将混匀样品置于室温下孵育5分钟，以获得最大回收率。

3. 将反应板置于 SPRIPlate 384 孔板磁力架 上 2 分钟，将磁珠从溶液中分离。

   重要提示: 待溶液澄清后，再进行下一步操作。

4. 当反应板置于 SPRIPlate 384 Post Magnet Plate上时，需执行以下步骤：

   —从反应板中吸取上清液并废弃。保留 5 μL 上清液，以避免磁珠会与上清液一同被吸出。

   重要提示: 待溶液澄清后，再进行下一步操作。

5. 重要提示: 当反应板仍置于SPRIPlate 384 Post Magnet Plate上时，执行以下步骤。注意不要扰动磁珠。另外，请务必彻底清洗孔底，以完全清除所有残留乙醇。

   将 30 μL 70% 的乙醇洗涤溶液加入至反应板的每个孔中，并置于室温下孵育 30 秒。吸出乙醇并废弃。

   注意: 如果样品加试剂的总体积超 200 μL，则洗涤样品的体积应至少为200μL。

   重复两次洗涤步骤。

   磁珠在乙醇中不易被吸取，因此无需保留上清液。

   注意: 为确保完全去除所有乙醇，可适当延长磁珠干燥时间。对于 10 kb 或更大的产物片段，请勿过度干燥磁珠（若干燥过度，磁珠会出现裂痕），从而大幅降低洗脱效率。

6. 从磁力板上取出反应板，然后向每个孔中加入 30 μL 洗脱缓冲液，使用移液器吸头反复吹打 10 次，确保充分混合。孵育 2 分钟。

   添加30 μL 洗脱液，确保液位足以完全接触磁珠。可增加洗脱缓冲液体积，但使用小于 15 μL的洗脱缓冲液时需额外进行混合步骤（以确保液体与磁珠充分接触），且可能导致无法完全洗脱所有产物。

7. 将反应板置于 SPRIPlate 384 Post Magnet Plate上 1 分钟，将磁珠从溶液中分离。

8. 将洗脱液转移至新板。

   注意: 通常无需担心磁珠转移到目标板中。可将样品与磁珠一同储存至冰箱，磁珠在下游的酶促反应中呈惰性。如果出于任何原因需限制磁珠残留，则可在母板中保留 2 μL – 5 μL 洗脱液。此外，可以将含有磁珠的溶液在磁力架上进行二次分离。为此，将含有磁珠的最终板放在磁力板上洗脱 1 分钟以分离磁珠。将洗脱液转移至另一块干净的板。