工作流程问题解答：福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织样本所面临的挑战

工作流程相关问题解答：从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本实验面临的挑战

下一代测序（NGS）可以提供对短序列的深入分析，这使其成为对从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织分离的核酸使用的强大工具。高级应用科学家 Jung Doh 最近解答了有关在下一代测序（NGS）样本制备工作流程中使用具有挑战性的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的十个常见问题。 他的解答和使用技巧分享如下。

1. 什么时候将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本用于下一代测序（NGS）能够优于使用新鲜冷冻的样本？

新鲜或速冻样本是 DNA 的重要来源，但是它们的收集和维护成本很高，因此无法广泛获得。这种低可用性使得它们无法用于大规模的肿瘤追溯性研究，而这些研究最终可能会推动新的癌症疗法的发展。

相比之下，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本在患者治疗和护理期间常规存档。据估计，全世界的医院和组织库中有 4 亿 ¹ 到十亿个 FFPE 样本²。许多具有临床注释——初步诊断、治疗方案、药物反应和复发状态——因此它们可以与临床结果和长期随访相关联³。

对于某些类型的肿瘤组织，FFPE样品通常是 DNA⁴ 的唯一来源。这些样本可以为研究人员提供有关某些最罕见的癌症和其他疾病的重要信息⁵。

2. 采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本的下一代测序（NGS）数据质量是否可以与采用新鲜冷冻样本的下一代测序（NGS）数据质量相匹配？

根据当前大量的文献记载，答案是肯定的。实际上，下一代测序（NGS）分析大量短序列的能力可能使其成为应用于从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中提取的片段化核酸的理想技术⁶。

例如，在最近的一项研究中，研究人员对从新鲜冷冻（FF）或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中提取的胃肠道间质瘤进行了全外显子组测序（WES）。通过改良的RAPD PCR方法评估FFPE DNA的完整性，以帮助将样本分类为高质量或低质量（HQ / LQ）。尽管 LQ-FFPE 的产量和插入片段较小，但对于两类FFPE而言，DNA 文库的生产和外显子组捕获都是可行的。 WES 从 FF 和 FFPE 产生质量相同的数据，而 HQ-FFPE 产生的数据量可与 FF 样本相比较⁷。

其他研究表明，FF 和 FFPE 样本的 NGS 数据之间具有很强的相关性^[6,8,9,10]，从而支持了从 FFPE 肿瘤组织的低投入 DNA 生成高质量测序文库和测序结果的可行性¹¹。

3. FFPE 样本处理是否会影响从包埋组织获得的 DNA 的产量和/或质量？

这是有可能的。当然，这不是 120 年前的问题，当时甲醛（福尔马林的主要成分）被认为是保存组织样本的优良固定剂¹²。病理学家和组织学家用福尔马林固定组织已有一个多世纪的历史¹³，但直到 1970 年代初，研究人员才发现福尔马林在细胞内大分子（例如蛋白质）与 DNA¹⁴ 之间产生交联。

福尔马林固定引起的另一种 DNA 损伤形式是片段化，可导致 PCR 扩增的可扩增模板量低¹⁵。研究人员还认为，由于暴露于环境条件下，福尔马林固定的样本的长期储存会诱导 DNA 碎片化^16,17。

然而，大量研究报告了将 FFPE 样本中的 DNA 与常规基于 PCR 的技术和 NGS 技术结合使用的可行性^5,18,19。尽管在使用较长扩增子的方法中，片段化可能是一个限速因素，但研究人员已成功使用片段化 FFPE DNA²⁰ 中较短的扩增子。

此外，其他研究人员表明，一些福尔马林诱导的修饰可以部分逆转²¹，这一过程现已包括在许多用于 FFPE 材料的核酸提取试剂盒中¹⁰。案例分析：一些研究报告了 FFPE 样品中较高的序列假突变实例（主要是 C：G > T：A 碱基置换）^9,22,23,24，而其他研究则几乎没有伪像的证据^5,25。无论如何，C：G > T：A 序列假突变主要由尿嘧啶损伤引起，在 PCR 扩增之前用尿嘧啶- DNA 糖基化酶处理 FFPE DNA 可以显着减少这些假突变，而不会影响真正的突变序列变化⁴。

此外，包括在室温下长期保存的 FFPE 制备过程可能会产生 DNA 突变，并导致鉴定错误的单核苷酸变体（SNV）或插入/缺失（indels）。但是，这种损坏似乎在所有 DNA 片段上都是随机分布的，可以通过选择较高的测序深度来纠正。因此，研究人员建议在分析 FFPE 材料时，覆盖度至少为 80 倍⁵。

最后，用于脱蜡的方法也可能影响提取的 DNA²⁶ 的扩增能力。使用的解链温度越高，双链 DNA 变性的机会就越大。但是，如果温度太低，石蜡可能无法完全融化，从而降低了潜在的核酸产量。不同的 FFPE 组织可能需要不同的石蜡熔化温度和时间。目的是在解链温度、DNA 质量和 DNA 产量之间达到可接受的平衡。推荐的最高温度为 90°C。高于此温度的条件会导致产生很大一部分单链DNA。一些研究人员建议，使用 75°C 的温度维持 5 分钟（仍足以熔化石蜡）可以保留双链 DNA⁵。

4. FFPE 样本的保藏时间长短是否会影响其提供可测序文库的能力？

通常，虽然实验成功往往取决于样本的原始固定方式、存储条件以及创建库的方法，但它并非一定如此。在最近的一项研究中，已留存超出 3 年的样本在 94％ 情况下都产生可测序文库，尽管对于较老的样本（14-21年），成功率降至 50％²⁷。其他研究人员发现，与当年制备的样本相比，从存储在 11-12 年，5-7 年或 1-2 年的区块中提取的大分子之间没有显着差异 ²⁸，其中一些报告成功地从留存达 20 年的 FFPE 组织样本所分离出的 RNA 中创建了文库⁶。

5. 我真的可以期望 10 至 20 年的 FFPE 样本具有可接受的测序质量吗？

留存有十多年的 FFPE 样本的序列质量下降的程度几乎可以忽略不计²⁹，这证实了使用 14 年和 18 年 FFPE 样本的研究的早期发现的可靠性²⁵。一些人称赞 NGS 技术的强大功能，可以对已保存长达 20 年的 FFPE 组织中的 DNA 和 RNA 进行分子分析⁶。无论如何，根据分析目的，从 40 年以上的 FFPE 组织样本中提取的核酸依旧可以成功用于分子分析³⁰。

6. FFPE DNA 样本的质量是否会影响下游基因组应用？

答案是肯定的，但更相关的问题应该是影响的程度大小。研究人员早已了解福尔马林固定过程会影响下游基因组应用，由于 DNA 交联 DNA 和蛋白质——导致聚合酶包裹——以及 DNA-DNA 交联抑制变性。³¹ 大多数关于 FFPE DNA 样本质量的担忧都集中在了突变筛选上，即便其中许多的疑虑——例如假突变，假阴性变体以及次优性能的变体分析算法——如今已被彻底的研究探讨，³² 但他们的影响程度依旧是未知的。

显而易见的是，DNA 降解和序列假突变的存在可能会阻碍突变检测，这些假突变可能被错误地解释为突变。尽管在 PCR 检测方法中使用较短的扩增子可以解决降解挑战，但尚未找到针对序列假突变问题的有效解决方案，除了在 PCR 扩增之前使用 uracil-DNA 糖基酶处理 FFPE DNA ⁴。

然而，尽管目前面临挑战，许多研究人员已经成功地使用 FFPE DNA 对单基因以及全外显子组^5、35 和全基因组进行靶向测序，进行拷贝数分析和突变检测。同时，有人建议，FFPE 样本可以成功地用于代替新鲜冷冻样本进行基因表达研究⁸。

7. 成功的 NGS 测序需要多少 FFPE DNA？

答案很大程度上取决于要生成的数据类型。投入量 ≤250 ng FFPE DNA 已报告不足以充分覆盖全外显子组³⁵，然而，在最近对 99 个 FFPE 样本的研究中，作者报告从 16 ng FFPE DNA 投入量中“成功地”测序全外显子组³⁶。也有研究报导已经从 FFPE DNA 的 10 ng 中成功进行了全基因组测序分析，但这仅限于拷贝数的变化分析³⁷。此外，也有仅用 5 ng FFPE 的模板 DNA 生成用于序列分析的片段库，生成染色体组型拷贝数，并且和从 1mg DNA 模板中生成的染色体组型没有区别。

大多数研究人员同意，这种测序的成功在很大程度上是由于 NGS 能够从 FFPE 中恢复的相对较短的 DNA 片段中提供可用数据，包括单基变化、插入/缺失和易位^29，38。

8. 我能否从 FFPE 样品中成功提取 RNA 和/或 miRNA？

是的。然而，从 FFPE 样本进行RNA测序可能是一个挑战，因为 RNA 比 DNA 的稳定性低。与其他应用中使用的 RNA 样本相比，FFPE 样本可能会降解，但仍可以从 FFPE 材料获得高质量的序列读取，以用于 miRNA 分析³⁹。由于其分子小，miRNA 可能不太容易降解和修饰，因此在 FFPE 标本中分析得到的复制子可能比在新鲜组织分析 mRNA 所得的序列更加精确。

一项研究表明，从包括来自 17 种组织类型和 65 个 FFPE 样本中分离获得 272 个 RNA，miRNA 不仅适合而且可能是受损害的存档临床标本的分子表征的优越分析物⁴⁰。如果目的是检测新的 miRNA，那么平台的首选可能是 NGS，它可以提供最多的数据，并且不需要事先知道要识别的序列³⁹。

9. 我能否使用 FFPE 组织检测过去疾病爆发的病毒 DNA？

这方面领域的专家们仍在对此进行研究。新的技术已被开发使已知的病毒序列在FFPE组织样本中得到检测，迄今为止，包括 1918 年 “西班牙” 甲型 H1N1 流感病毒的复原。使用从该著名流行疾病的患者的 FFPE 肺组织样本中提取的 RNA，该病毒被表征，然后通过反向遗传学41复原。此外，与 NGS 结合的序列独立扩增已用于检测各种 FFPE 样本中的新病毒，但目前仍不确定是否可采用相同的技术来检测此类样本中的已知和未知病毒^42，43，44。

10. FFPE 样品的 NGS 测序中所有生物信息学工具都同样可靠？

事实并非如此。尽管许多研究人员已经预见到第三代测序技术的潜力，但仍然没有被广泛接受的黄金标准方法以用于分析 NGS 数据⁴⁵，也没有商定的序列质量控制标准数据⁴⁶。尽管已经为 NGS 数据开发了各种生物信息分析工具，但它们的可重复性仍有待提高。

目前，所有商用 NGS 平台都有不同的错误类型/速率，用户应仔细评估和解决每种错误类型，以尽量减少对下游数据分析的潜在影响。应用不同的生物信息学策略也会影响 NGS 数据分析，这就是为什么用户还必须了解这些工具的工作原理、优点和局限性，以帮助确保对其结果的最大信任度⁴⁶。

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