贝克曼库尔特（Beckman Coulter）BioLector XT与Multisizer 4e在植物细胞培养监测与表征中的应用

本文基于植物细胞悬浮培养中“在线监测难、聚集体难表征”的问题，结合实验数据，介绍了贝克曼库尔特（Beckman Coulter）BioLector XT微型生物反应器与Multisizer 4e库尔特计数器的应用。

在烟草BY-2转基因细胞培养实验中，BioLector XT实现了在不取样条件下对生物量、GFP表达、NAD(P)H、pH及溶氧的实时监测，并观察到生物量指数增长、pH先降后升（约5.0→6.5）、DO下降至约85%的变化趋势

在碳源对比实验中，尽管不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖）及接种量（5%/10% v/v）下终点生物量无明显差异，但生长速率存在显著差别，例如10%蔗糖条件约100小时达到最大生物量，而5%葡萄糖约190小时

Multisizer 4e基于库尔特原理测得细胞尺寸分布主要集中在30–320 µm范围内，并通过DPP技术实现单颗粒级别的数据分析

上述系统分别用于培养过程监测与细胞群体表征，实验结果表明其可用于分析培养条件对细胞行为的影响，但相关生物学结果仍取决于体系与设计条件。

一、研究背景

植物细胞培养是一种无菌、可控的生物技术体系，广泛应用于：

  • 植物代谢物生产（如紫杉醇）
  • 植物细胞分化研究
  • 工业化生物制造

在实际应用中，实现高效培养依赖对以下过程的控制：

  • 细胞生长
  • 代谢状态
  • 环境参数

二、关键技术挑战

在传统实验条件下，常见问题包括：

1. 取样干扰

获取pH和生物量数据通常需要中断培养体系，特别是在存在细胞团块时取样困难。

2. 数据连续性不足

离线检测只能提供离散时间点数据，难以捕捉动态变化。

3. 聚集体表征困难

植物细胞在悬浮培养中易形成团块，难以通过传统光学方法准确测量。

4. 通量限制

多条件优化实验依赖大量摇瓶培养，效率较低。

三、技术方案

本研究采用：

  • 贝克曼库尔特（Beckman Coulter）BioLector XT
    （用于在线培养监测）
  • 贝克曼库尔特（Beckman Coulter）Multisizer 4e
    （用于细胞尺寸与聚集状态分析）

两者分别对应：

  • 过程监控（在线）
  • 结构表征（离线但高分辨）

四、BioLector XT在线监测实验

4.1 实验体系

细胞系：

  • 烟草BY-2转基因细胞（表达GFP）

4.2 预培养条件

  • 种子液：20 mL培养7天
  • 接种至：180 mL培养基（pH 5.8）
  • 添加：100 mg硫酸卡那霉素
  • 培养条件：
    • 温度：20°C
    • 转速：190 rpm（振幅50 mm）

4.3 培养基组成

  • 4.4 g/L MSMO基础盐
  • 0.2 g/L KH₂PO₄
  • 0.2 mg/L 2,4-D
  • 0.6 mg/L 硫胺素
  • 30 g/L 碳源

4.4 主培养条件（BioLector XT）

  • 温度：26°C
  • 振荡：1000 rpm（振幅3 mm）
  • 48孔板体系

4.5 实验设计

实验1（监测能力验证）

  • 接种量：10%（v/v）
  • 设置：5个独立孔

监测参数：

  • 生物量（散射光）
  • GFP荧光
  • NAD(P)H
  • pH
  • 溶氧（DO）

实验2（条件优化）

变量：

  • 碳源：葡萄糖 / 果糖 / 蔗糖（30 g/L）
  • 接种量：5% / 10%

五、BioLector实验结果

5.1 生长曲线

  • 生物量呈指数增长
  • ~110小时出现信号下降

👉 原因解释：

  • 并非生物量下降
  • 而是细胞由圆形→伸长
  • 导致散射光变化

5.2 荧光与代谢

  • GFP表达随生长增加
  • NAD(P)H与生物量高度相关

5.3 pH变化

  • 前24小时降至约5.0
  • 随后升至约6.5

5.4 溶氧（DO）

  • 持续下降
  • 最低约85%

5.5 重复性

  • 五个孔表现一致
    👉 说明系统数据一致性良好

5.6 碳源实验结果

结论分两点：

（1）终点生物量

👉 无显著差异

（2）生长速率差异

条件

达到最大生物量时间

10%蔗糖

~100小时

5%葡萄糖

~190小时

👉 生长速率明显不同

                     

六、Multisizer 4e细胞表征实验

6.1 技术原理

基于库尔特原理：

  • 颗粒通过孔径
  • 导致电阻变化
  • 电压脉冲对应颗粒体积

6.2 实验条件

  • 稀释：1:200
  • 取样：500 µL
  • 孔径：1000 µm
  • 测量时间：120秒
  • 通道数：400

6.3 实验结果

细胞尺寸分布

  • 范围：约30–320 µm

DPP数据分析

特点：

  • 脉冲宽度 vs 高度散点图
  • 支持筛选特定区间

示例：

  • 选取40–140 µm区间
  • 获得直径分布直方图

6.4 数据用途

  • 分析细胞尺寸变化
  • 研究聚集体形成
  • 比较不同培养条件

七、联合应用分析

阶段

BioLector XT

Multisizer 4e

筛选

高通量培养条件测试

细胞尺寸评估

监测

实时生长与代谢数据

聚集状态分析

验证

放大前参数评估

批次一致性分析

👉 两者功能互补

八、综合结论

贝克曼库尔特（Beckman Coulter）BioLector XT与Multisizer 4e在该研究中分别提供培养监测与细胞表征能力。

其作用包括：

  • 获取连续培养数据
  • 提供细胞尺寸定量信息
  • 支持培养条件比较分析

需要强调：

细胞生长行为及聚集现象由培养体系和工艺参数决定，上述系统仅用于数据获取与分析支持，不直接改变生物学结果。

FAQ

Q1：BioLector XT是否影响细胞生长？
不会，仅用于监测。

Q2：Multisizer是否能消除聚集体？
不能，仅用于测量。

Q3：为什么需要两种设备？
一个监测过程，一个分析结构。

Q4：实验结果是否由设备决定？
不是，由培养体系决定。

Q5：该方案适合哪些研究？
植物细胞培养优化、代谢工程表征等。

其他离心技术