摘要

在藻类培养实验中，总细胞计数和细菌污染监测是评估培养状态的重要内容。基于库尔特原理的颗粒计数方法可在测定藻类总细胞数的同时，通过颗粒体积分布识别细菌污染。贝克曼库尔特（Beckman Coulter）Multisizer 4e 库尔特计数器配合100 μm小孔管，可覆盖藻类细胞常见尺寸范围，并对体积小于20 μm³的颗粒具有检测灵敏度，适用于藻类液体培养过程中细菌污染的辅助检测。

一、研究背景：藻类培养与细胞计数需求

在金藻纲（Chrysophyceae）中，既有仅利用光能并以二氧化碳为无机碳源的自养型物种，也有依赖有机碳源生长的异养型物种。同时，部分藻类具备在不同环境条件下切换无机碳与有机碳代谢途径的能力，即混合营养型生长策略。

在研究不同营养条件下藻类生长行为时，总细胞计数是评估培养状态和生长速率的基础指标。然而，在含有有机碳源的液体培养体系中，即使采用无菌操作，培养物仍然面临较高的细菌污染风险。

传统细菌检测方法（如培养基涂布、显微镜观察或荧光染色）通常需要额外实验步骤。相比之下，基于颗粒体积分析的库尔特计数方法，有可能在进行藻类总细胞计数的同时，提供细菌污染的辅助判断信息。

二、Multisizer 4e 库尔特计数器在藻类培养中的应用思路

贝克曼库尔特生命科学（Beckman Coulter Life Sciences）Multisizer 4e 库尔特计数器是一种基于库尔特原理的颗粒计数与体积分布分析系统，可对液体样品中不同尺寸范围的颗粒进行定量测量。

在藻类培养实验中，该类库尔特计数器主要用于：

• 测定藻类培养物的总细胞数
• 获取藻类细胞的体积与粒径分布
• 在特定条件下，通过低体积区间颗粒的异常增加，判断是否存在细菌污染风险

该方法并非直接鉴定细菌类型，而是基于颗粒尺寸分布特征，作为培养状态评估的一种补充手段。

三、实验培养条件与藻类模型

实验选用两种混合营养型金藻：

• 奥杜藻（Ochromonas danica）
• 马尔汉棕鞭藻（Poterioochromonas malhamensis）

藻类采用含可溶性有机碳源的液体培养基，在以下条件下静置培养：

• 温度：20 °C
• 光照强度：30 μmol 光子·m⁻²·s⁻¹

上述培养条件有利于藻类生长，但同时也增加了细菌污染的潜在风险。

图1：含有机碳源培养基中奥杜藻液体培养物的不同生长阶段

四、基于 Multisizer 4e 的总细胞数测定方法

所有藻类培养样品的总细胞数均使用Multisizer 库尔特计数器测定。实验设置如下：

• 小孔管规格：100 μm（适用于预期直径 3–15 μm 的藻类细胞）
• 样品体积：50–500 μL
• 稀释介质：12 mL Isoton II 电解液
• 每个样品进行三次重复测量，取平均值
• 使用培养基空白样品进行背景扣除

通过 Multisizer 分析软件，对颗粒体积数据进行校正与统计，获得可靠的总细胞计数结果。

图2：不同藻类细胞的光学显微镜图像（A）奥杜藻的两个单独细胞；（B）马尔汉棕鞭藻的单个细胞

五、对细菌粒径范围颗粒的检测灵敏度评估

为评估 Multisizer 4e 在藻类培养中检测细菌粒径范围颗粒的能力，实验将马尔汉棕鞭藻培养物与不同浓度的热灭活细菌混合，并进行对比分析。

重点观察的体积区间为：

• < 20 μm³（约对应直径 < 3 μm），该区间通常不包含完整藻类细胞

结果表明：

• 在无菌藻类培养物中，该体积区间内未出现显著颗粒峰值
• 在指数生长期，若该体积范围内颗粒浓度显著升高，且超过藻类群体对应体积区间（20–2000 μm³），可作为细菌污染的特征性表现
• 在低细菌浓度条件下，Multisizer 4e 已能通过粒度分布检测到细菌峰值，而显微镜尚难以观察

需要注意的是，在生长后期或稳定期，藻类细胞裂解产生的小颗粒可能影响该区间的判读，因此该方法更适用于指数生长期的培养监测。

图4：指数生长期的奥杜藻培养物（含细菌污染：红色曲线；无细菌污染：蓝色曲线）在无菌培养物中（蓝色曲线），指数生长期仅能检测到藻类特征峰（5-20 μm）；红色曲线则显示实验过程中细菌污染大量滋生的培养物的特征粒径分布，除藻类峰外，在直径<3 μm范围内可见典型的细菌峰。

图5：添加与未添加热灭活细菌的马尔汉棕鞭藻培养物对比。（A）细胞体积分布：未添加细菌（绿色曲线）、细菌密度OD600=2（红色曲线）、细菌密度OD600=0.05（黑色曲线）、细菌密度OD600=0.03（蓝色曲线）；  （B）细菌的显微镜检测：核酸经SYBR-Green染色呈绿色，叶绿素自发荧光呈红色。未添加细菌的培养物中，绿色荧光可完全归属于特定藻类细胞；添加细菌的培养物中，藻类细胞外也出现绿色荧光，该荧光来源于同样被染色的添加细菌的核酸。

六、结果总结与应用边界说明

实验结果表明：

• Multisizer 4e 库尔特计数器可可靠用于藻类培养过程中的总细胞计数
• 在特定培养阶段（尤其是指数生长期），通过颗粒体积分布可识别细菌污染迹象
• 该方法可在不增加额外实验流程的前提下，作为藻类培养无菌性监测的辅助手段

该结论基于颗粒尺寸分布现象，不涉及细菌种类鉴定，也不替代传统微生物检测方法。

FAQ

Q1：藻类培养实验中常用什么设备做总细胞计数？

A： 在液体藻类培养中，常采用基于库尔特原理的颗粒计数设备进行总细胞数测定，例如贝克曼库尔特 Multisizer 4e 库尔特计数器。

Q2：Multisizer 4e 可以检测藻类培养中的细菌污染吗？

A： Multisizer 4e 并非直接检测细菌种类，但在特定条件下，可通过低体积区间颗粒数量异常增加，作为细菌污染的辅助判断依据。

Q3：为什么选用100 μm小孔管？

A： 该规格可覆盖藻类细胞常见尺寸范围，同时对体积小于20 μm³的细菌特征区间保持检测灵敏度。

Q4：这种方法是否适用于所有培养阶段？

A： 更适用于指数生长期。在后期阶段，小颗粒可能来源于藻类裂解，需要结合培养阶段谨慎解读。