BioLector XT 新一代高通量微型生物反应器益生菌厌氧培养工艺研究

前言

益生菌是活细菌，据说对人体具有促进健康和发挥生物功能的作用。它们通常用于增加肠道所需微生物的数量，
譬如在抗生素治疗后促进肠道菌群再生。这就是益生菌或益生菌营养补充剂市场大幅度增长的原因之一¹。人体肠道菌群及其健康促进作用的研究对营养产业尤为重要。因此，完全有必要对厌氧或微量需氧培养技术进行科学研究，比如在类似这些微生物的生长条件下培养益生菌。益生菌包括一系列厌氧菌，如乳酸菌或双歧杆菌。在各种益生菌中，双歧杆菌是应用和研究最广泛的益生菌菌种之一。由于它们无法在有氧培养条件下进行氧呼吸和生长，因此被归类为严格厌氧菌2，它们是人体肠道优势微生物群的主要成员.³它们通过释放乳酸和乙酸，在pH控制方面起着重要的作用，这一点制了许多潜在致病菌的生长。⁴母乳喂养的婴儿肠道内双歧杆菌为优势菌种，占肠道微生物的80%以上^1,5。乳酸杆菌属的已知菌种达200多种，该属是美国食品药品监督管理局（FDA）公认安全（GRAS）乳酸杆菌中数量最大、种类最多的一个属。由于乳酸杆菌具有良好的保健应用前景，它们作为乳制品发酵剂或益生菌已得到广泛的研究和应用⁶。

在本《应用指南》中，我们介绍使用 BioLector XT新一代微型生物反应器 结合气体处理器进行厌氧培养实验。BioLector XT 新一代高通量微型生物反应器是一款用于微生物培养高通量筛选的台式设备，可在线监测常见的培养参数，如生物量、pH值、溶氧（DO）和各种荧光分子或蛋白质的荧光强度。为了实现高通量，我们在SBS/SLAS标准化微孔板（每板48个孔）上进行培养，这样即可在一台 BioLector XT 微型生物反应器中同时处理多达48个样品。此外，我们使用BioLectorXT微型生物反应器气体处理器（见图1）对益生菌干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和两岐双岐杆菌（Bifidobacterium bifidum）进行厌氧分批培养和补料分批培养，展示其操作的简单易用性。BioLector XT 微型生物反应器气体处理器的一个主要优点，是能够在微孔板（MTP）上直接充氮（比如100%浓度的N2）的过程中同时补料和控制pH，氮气流量可在 5–50 mL/min 范围内进行调节。

方法

乳酸杆菌菌株厌氧培养

乳酸杆菌菌种（干酪乳杆菌 DSM 20011 或植物乳杆菌DSM 20174）均在环境温度为37 °C 的厌氧条件下使用MRS肉汤培养基（Carl Roth，德国）培养。MRS肉汤添加0.5 g/L Cysteine- HCL（半胱氨酸盐酸盐），后者通过还原培养基中残留的分子氧，充当氧化还原电位的还原剂。预培养均在250mL锥形瓶中进行。为此，将1mL冷冻培养物接种到20mL制备好的MRS肉汤培养基中，然后在厌氧条件下培养至少24小时。将MRS肉汤中主培养的OD起始值设为1 。随后 在BioLector XT 微型生物反应器中使用NextGen-Microfluidic圆孔板进行p H 受控的分批培养和补料分批培养。培养温度37°C，转速600 rpm，开启湿度控制。培养孔起始体积设为2,000μL，最大体积设为2,400μL。使用BioLector XT微型生物反应器在线监测生物量（增益3）以及pH值(LG1）和溶解氧（DO）（RF）。表1给出干酪乳杆菌补料分批培养条件更详细的概述。

表1. 干酪乳杆菌补料分批培养条件。

两岐双岐杆菌的厌氧培养

两岐双岐杆菌（SinoPlaSanAG,Germany）均在环境温度为37°C的厌氧条件下使用MRS肉汤培养基（Carl Roth，德国）培养。MRS肉汤添加0.5g/Lcysteine-HCl，后者通过还原培养基中残留的分子氧，充当氧化还原电位的还原剂。预培养均在250mL锥形瓶中进行。为此，将一粒胶囊的内容物接种到20mL MRS肉汤培养基中，然后在37°C厌氧条件下培养至少24小时。MRS肉汤中主培养的OD_起始设为 1.0。

在BioLector XT微型生物反应器中进行主培养，即pH受控的分批培养和补料分批培养。培养温度37°C，转速600rpm，开启湿度控制。使用BioLectorXT微型生物反应器在线监测生物量（增益3）、pH值（LG1）和DO（RF）。表2给出两岐双岐杆菌补料分批培养条件更详细的概述。

表 2. 两歧双歧杆菌补料分批培养条件。

两岐双岐杆菌的厌氧培养

图2.NextGen-Microfluidic 圆孔板示意图

A行装填 1,900µL葡萄糖补料溶液，B行装填 1,900µL pH 调节剂。在BioLector软件中，如果是水溶液（3M NaOH），则泵容积调整为0.30µL，较粘稠的补料液体（500g/L葡萄糖）则调整为0.16µL。在所有补料分批培养实验中，按时间触发补料操作，补料速度设为恒定的4µL/h。pH控制设为pH=6.0。在NextGen-Microfluidic圆孔板上进行培养的过程中，通过使用BioLector XT微型生物反应器气体处理器获得厌氧环境，该气体处理器安装在被透气性无菌密封膜（F-GPRSMF32-1）密封好的MTP上。

结果

BioLector XT 微型生物反应器用于干酪乳酸杆菌的补料分批培养

在MRS肉汤培养基中培养干酪乳酸杆菌的过程见图3。左图显示生物量和溶解氧（DO）的在线信号以及所添加补料溶液（500g/L葡萄糖）的体积。下图为在线 pH 值和相应 NaOH 体积与培养时间的关系图。

图3.采用配备气体处理器的 BioLector XT 微型生物反应器培养干酪乳酸杆菌

这里采用三种不同的工艺设置：一种是分批培养，另外两种是补料分批培养。一种在7.5小时后开始补料，另一种则在10小时后开始补料。以30mL/min流量连续充入N2，DO稳步下降。45分钟后，DO降至5%以下，并逐步下降。4.5小时后，DO低于0.5%，并继续降至0%。6.7小时左右培养步入稳定期，指数增长停止，在此时间点三种培养方法的生物量信号均为42 a.u.。分批培养的微生物进一步缓慢增长，9.5小时后生物量达到最大值44a.u.，随后稳步下降，培养结束时最终生物量信号为38a.u.。生物量信号增大与补料溶液添加有关。补料一开始，就可以看见生物量信号增加。7.5h补料分批培养工艺的最终生物量信号为76.3a.u.，而使用10h补料分批培养工艺30小时后，最终生物量信号为65.5a.u.。所添加碱液的值与生长相关。进入稳定期后细菌不再生长，因此不再产酸，所以稳定期开始后停止添加3M NaOH。在恒定添加补料溶液的模式下，产酸继续进行，为保持6.0的pH设定值，需要进一步添加碱液。

综上所述，本实验表明，BioLector XT 微型生物反应器结合气体处理器，通过直接厌氧充气，在补料的同时控制pH 值，因此很适合厌氧培养。

BioLector XT 微型生物反应器厌氧条件的技术和生物验证

在整个培养过程中保持厌氧条件，是培养氧敏感生物的关键要求。在接下来的实验中，我们在BioLector XT微型生物反应器出气口安装一个外置氧传感器（ FTM Pst6 传感器 / Fibox 4 trace，PreSens Precision Sensing GmbH，Germany），用来验证BioLector XT气体处理器的技术功能以及密封性，从而证明厌氧环境。

图4给出植物乳杆菌分批培养的实验数据。左图显示在线生物量信号（增益3），右图显示肉汤培养基中溶解氧的在线信号、BioLector XT 微型生物反应器出气口氧浓度、在线 pH 信号以及为控制pH而添加的NaOH体积。

2.86h滞后期之后，开始指数生长。7.96h后进入稳定期，此时最终生物量信号为155.865 a.u.（OD600 = 9.01 ± 0.07）。植物乳杆菌在生长过程中分泌乳酸。生长期产酸与为保持pH6而添加的NaOH体积相关。按30mL/min流量持续充入N2，DO稳步下降。39分钟后，DO降至5%以下，并逐步下降。4小时后，DO低于0.5%，并继续降至0%。培养16小时后，外置传感器显示最终氧浓度为 0.029%。

图4.在配备气体处理器的 BioLector XT 微型生物反应器中采用生物学重复方式培养植物乳杆菌。

本培养实验验证了技术功能，但乳酸杆菌也可以在有氧条件下生长，甚至可以代谢氧气，这一事实表明在BioLector XT 微型生物反应器中进行厌氧培养的生物学验证证据不够充足。因此，我们培养了严格厌氧菌两歧双歧杆菌。该菌株的成功培养，从生物学上验证了可在 BioLector XT微型生物反应器中进行厌氧培养这一事实。图5给出两歧双歧杆菌分批培养和补料分批培养的实验数据。左图为生物量在线信号和添加补料体积与培养时间的关系图。右图显示 pH 和 DO 在线信号（光学传感器）、3 M NaOH添加量以及微型生物反应器出气口外置气体传感器的氧信号。

图5.在配备气体处理器的 BioLector XT 微型生物反应器中采用生物学重复方式培养两歧双歧杆菌。

2.4小时滞后期之后，开始指数生长，分批培养的生物量信号最终值为147.57a.u.（OD600 = 8.3 ± 0.57）。我们发现，补料分批培养的指数生长期比分批培养长，原因在于，6小时后开始补料，所以培养基中葡萄糖含量更高。培养23小时后，生物量达到最大值227.3 a.u.（OD600 =15.93 ±0.69）。两歧双歧杆菌在生长过程中分泌乳酸，分泌量与生长相关，这在为保持pH6而添加NaOH的添加量曲线上可以观察到。总共将193.56μL 3 M NaOH 泵送到肉汤培养基中。按30mL/min 流量连续充入N2，DO稳步下降。植物乳杆菌和两歧双歧杆菌培养后前16小时获得的外部氧数据（如前所述），是在同一段运行时间内同时获得的，因此，使用了相同的MTP、气体处理器和外置气体传感器。可以观察到DO信号在18小时后略有增加，这是氧光学传感器在技术处理时出现信号漂移所致，氧为0%时每日漂移量为<0.5%O2。外置氧传感器数据显示，23小时后BioLector XT微型生物反应器出气口的氧浓度为0.029%，证实整个培养过程中厌氧培养条件得以保持。

总之，我们证明了可在BioLector XT微型生物反应器中成功进行厌氧生物培养实验。通过结合微流控芯片技术和气体处理器，在小规模培养中同时进行pH控制、补料和直接充氮气不再是问题。

结论

综上所述，我们对 BioLector XT新一代高通量微型生物反应器结合其厌氧气体处理器用于培养乳酸杆菌和两歧双歧杆菌等益生菌进行了技术和生物验证。微流控芯片技术与气体处理器相结合，可在小规模培养系统中同时进行pH 控制、补料和直接充氮。这套系统适用于厌氧菌培养。

参考文献

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