推动常规高复杂度临床流式细胞术规范发展

一些现行的临床流式细胞术“规范”涉及该技术在恶性血液病表型分析中的重要应用，及其与其他检测方法共同在疾病诊断、提供治疗方案和监测患者方面发挥的重要作用。唯有历经时间验证，才能知晓这项强大分析技术将如何推动未来临床试验室的不断发展。然而，回首过去十年间，技术创新驱动流式细胞术实现了突破性变革。由此，我们可以预见，该项技术的重要性将愈加凸显。

当前，除了在疾病诊断方面的广泛应用，流式细胞术还在细胞生物学研究和药物发现领域大展身手。这一演变得益于针对悬浮细胞分析参数的大幅增加。第一台流式细胞仪仅配备一个激光器、四个检测器，体积大如一辆小汽车，但仅能测定三至四个参数。然而，今天的流式细胞仪（包括细胞分选仪）支持分析30多个参数，搭载最新技术的台式分析仪占用空间更小，性能更加出色。

模式转变

当前，体积更加小巧而性能更加强劲正成为仪器设计新趋势，这种模式的转变主要由临床实验室的需求所推动。他们希望获得流式细胞术分析能力，但却不想在学习使用仪器方面投入大量时间。随着关键技术的进步，流式细胞术得以广泛普及。设备研究人员正积极利用其它科学领域（如电信行业）的卓越理念，设计性能更佳的小型化子系统。与以往价格高昂的系统相比，这些紧凑型高性能系统不仅性能更加强劲，而且易于安装、操作和维护，使更多临床实验室最大限度地提高流式检测能力。

发现更多的能力

通常，流式细胞仪的性能主要通过分辨率以及弱荧光和/或稀少细胞群的检测灵敏度来衡量。就这一点而言，进行高效光管理以获得荧光标记细胞最优激发和发射条件，对提高性能而言至关重要

图1. 波分复用检测（WDM）模块采用雪崩光电二极管（APD）替代传统光电倍增管（PMT）。APD的显著特点之一是光电转化效率超过80%，特别是波长大于800nm时。

在传统的流式细胞仪中，激光光源通过一系列透镜和滤光片进行整形和聚焦在流动室上，而细胞则以流体动力学原理聚焦在流动室中心。。而全新流式细胞仪则采用独特激光设计，将激光聚焦至集成光学元件的流动室。这些系统不仅可以增加胞膜和胞内染料的激发效率，还可提高发射光的收集效率，方便整合和测量。设计紧凑型临床流式细胞仪时，可利用光纤进行光传输，这种高效的传输方式支持系统组件灵活布局。这些光纤可捕获发射光，将其传输至一个独特的检测器阵列，减少通道之间的串扰，从而提高性能。

借鉴电信行业的关键设计概念，波分复用检测（WDM）模块成为当前流式细胞仪的另一大发展趋势，该模块主要用于光检测和测量。波分复用是一种用于分离和测量与分析参数相关的多种不同波长光信号的方法。用于测量各个参数的检测器为雪崩光电二极管（APD），这是一种高度灵敏的半导体元件。而传统临床流式细胞仪目前配备（而且继续沿用）光电倍增管（PMT）。

与光电倍增管（PMT）比较，雪崩光电二极管（APD）的主要优点包括但不限于：

1. 提高线性度
2. 4~5倍光电转换效率（图1）；
3. 更宽动态范围（10⁶相较于10³）；
4. 尺寸更小而成本更低。

图2为第一台使用紧凑型APD的市售临床流式细胞仪的WDM模块，仪器整体体积得以大幅缩减（图为贝克曼库尔特DxFLEX流式细胞仪）。每个WDM模块都包含光学和检测器组件，可选择性测量特定波长，有效改善光收集效果，提高弱阳性细胞群的检测灵敏度。

图2. WDM模块利用光纤和带通滤光片进行分光

WDM设计创新简约，仅使用一个带通滤光片选择多色光。相比之下，传统临床流式细胞仪使用一系列双向色性滤光片和带通滤光片，沿阵列反射光线，导致可用光逐渐减少，光收集效率降低，最终影响荧光灵敏度和分辨率（图3）。

图3. WDM模块无需使用多个双向色性滤光片引导光路。尽可能减少折射导致的光损失，光效率得以提升。

简化高复杂性

由于信号具有可预测性，利用流式细胞仪APD检测系统的线性度，可大幅简化高复杂性。在日常质量控制过程中进行增益线性化和标准化，有效解决了仪器设置中常见的相对变化问题。此外，使用软件仅调节增益的方法，可简化高复杂度试验设置。增益调节线性度同样能够简化原本繁重的荧光补偿任务，以往这种任务阻碍了实验人员检测更多颜色/参数。为了最大限度发挥APD线性的优势，研究人员开发出全新软件算法，通过简化补偿促进高复杂度试验的设置和分析。

现在，用户可创建一个补偿库，用以存储每个参数和多色组合的APD增益设置和荧光溢出系数，也可以从库中选择各种单色，构建虚拟荧光补偿矩阵。此外，由于线性APD具有预测响应功能，当调节增益时，补偿库能够同步自动调节补偿值。因此，高复杂度应用的设置变得极为简单和直观。

粒径因素

大多数流式细胞仪利用488nm蓝色激光的前向散射光提供相对粒径信息，因此难以测定粒径小于300nm的颗粒。在这些系统中，小于1 μ m（1000 nm）的颗粒通常呈现低于激光和检测器子系统的噪声阈值。相比之下，新系统采用米氏散射原理。该原理预测，激发波长越短，散射光数量将增加，分辨率也会相应提高。

因此，通过测量较短波长405nm紫激光的散射光，系统可以分辨更小粒径颗粒。采用紫色侧向散射光参数的系统，可以检测粒径小于0.2µm（200 nm）的颗粒，支持超高微粒分辨率。

未来已来

强大性能与创新设计、技术的完美组合，即可打造易于使用的紧凑型流式细胞仪。通过积极推动传统流式细胞术的“规范”，当前及未来的流式细胞仪将持续简化临床实验室高复杂度应用，帮助实验人员深度探索造血系统肿瘤前沿应用。当前，流式细胞术仍然是探寻复杂问题的有效工具。临床实验室希望充分利用其强大功能，同时期待外形更加小巧、功能更加强劲、成本更加经济、操作更加便捷的流式细胞仪。依托现代创新成果，工程师将打造出更加令人满意的解决方案，届时该挑战必将迎刃而解。